在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，精確檢測(cè)生物分子的含量和活性是探索生命奧秘、攻克疾病難題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的酶標(biāo)儀作為一種能夠快速、高效測(cè)定微孔板中吸光度或熒光強(qiáng)度的儀器，在眾多科研實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮著不可或缺的作用。本實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)血清中某腫瘤標(biāo)志物含量為例，詳細(xì)介紹酶標(biāo)儀在科研實(shí)驗(yàn)中的具體應(yīng)用過(guò)程。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)結(jié)合酶標(biāo)儀，準(zhǔn)確測(cè)定不同患者血清樣本中腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）的含量，通過(guò)分析其含量差異，為腫瘤的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持，并驗(yàn)證酶標(biāo)儀在該類(lèi)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的準(zhǔn)確性和可靠性。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（一） 實(shí)驗(yàn)材料

1、樣本：收集30份臨床患者血清樣本，其中包括10份確診肝癌患者血清10份肝硬化患者血清以及10份健康人血清，所有樣本均經(jīng)過(guò)倫理審查并獲得患者知情同意，采集后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

2、試劑：AFP ELISA檢測(cè)試劑盒（包含預(yù)包被AFP抗體的微孔板、AFP標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素、底物顯色液、終止液、洗滌緩沖液等）、磷酸鹽緩沖液（PBS）。

3、儀器：酶標(biāo)儀（具備450nm波長(zhǎng)檢測(cè)功能）、恒溫培養(yǎng)箱、微量移液器及配套吸頭、振蕩器、離心機(jī)。

（二）樣本分組與處理

將30份血清樣本按照疾病類(lèi)型分為肝癌組、肝硬化組和健康對(duì)照組，每組10個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)前將血清樣本從-80℃冰箱取出，置于室溫下緩慢解凍，輕輕顛倒混勻后，以3000rpm離心10分鐘，取上清液用于后續(xù)檢測(cè)，避免樣本中雜質(zhì)影響檢測(cè)結(jié)果。

三、實(shí)驗(yàn)操作步驟

（一） 準(zhǔn)備工作

1、從冰箱中取出AFP ELISA 檢測(cè)試劑盒，平衡至室溫（約30分鐘），同時(shí)將洗滌緩沖液用蒸餾水按1:20比例稀釋備用。

2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將所需的微孔板條放入微孔板框架中，剩余的板條密封后放回試劑盒中，置于4℃保存。

（二） 加樣

1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：在1.5ml離心管中，將AFP標(biāo)準(zhǔn)品按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)苽錆舛纫来螢?ng/mL（空白對(duì)照）、5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、625ng/mL、3125ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2、加樣：分別取50μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入對(duì)應(yīng)的微孔中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；然后取50μl血清樣本加入相應(yīng)的微孔，同樣每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加樣時(shí)，移液器吸頭應(yīng)垂直懸空于微孔上方，避免吸頭觸碰孔壁，防止樣本交叉污染。

（三） 溫育與洗滌

1、加樣完成后，在每孔中加入50μl生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，輕輕振蕩微孔板使溶液混合均勻，用封板膜密封微孔板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育60分鐘，使抗體與抗原充分結(jié)合。

2、溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入350μl洗滌緩沖液，靜置30秒后甩干，重復(fù)洗滌5次，以徹底去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少背景干擾。洗滌過(guò)程中，可使用振蕩器輔助，確保洗滌充分。

（四） 顯色與終止反應(yīng)

1、每孔加入100μlHRP標(biāo)記的鏈霉親和素，輕輕振蕩混勻，再次用封板膜密封，37℃溫育30分鐘。

2、溫育結(jié)束后，重復(fù)上述洗滌步驟5次。

3、每孔加入100μl底物顯色液，輕輕振蕩后，室溫避光顯色15-20分鐘，觀察到標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯顏色變化。

4、每孔加入50μl終止液，終止顯色反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。

（五）酶標(biāo)儀檢測(cè)

將微孔板放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。在檢測(cè)前，確保酶標(biāo)儀預(yù)熱至穩(wěn)定狀態(tài)，并按照儀器操作手冊(cè)進(jìn)行校準(zhǔn)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

（一）原始數(shù)據(jù)整理

記錄酶標(biāo)儀檢測(cè)得到的各標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔的OD值，剔除明顯異常的OD值（如因加樣失誤、孔內(nèi)有氣泡等導(dǎo)致的數(shù)據(jù)），計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和樣本的OD值平均值。

（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

以AFP標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD值平均值為縱坐標(biāo)，使用GraphPad Prism或Excel軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。選擇合適的曲線(xiàn)擬合方式（如四參數(shù)邏輯回歸模型），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，確保標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.99，以保證曲線(xiàn)的可靠性。

（三）樣本濃度計(jì)算

將樣本的OD值平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，計(jì)算出各血清樣本中AFP的濃度。同時(shí)，計(jì)算每組樣本（肝癌組、肝硬化組、健康對(duì)照組）AFP濃度的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和置信區(qū)間。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較三組樣本AFP濃度的差異，若差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步使用Tukey多重比較法進(jìn)行組間兩兩比較，明確不同組之間的具體差異。

（五） 結(jié)果呈現(xiàn)

1、以表格形式展示各標(biāo)準(zhǔn)品濃度、對(duì)應(yīng)的OD值平均值以及樣本的AFP濃度計(jì)算結(jié)果。

2、繪制柱狀圖直觀呈現(xiàn)三組樣本AFP濃度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，清晰展示不同組之間AFP含量的差異。

3、結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，撰寫(xiě)結(jié)果分析報(bào)告，闡述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所反映的生物學(xué)意義，如肝癌患者血清中AFP濃度顯著高于肝硬化患者和健康人，驗(yàn)證AFP作為腫瘤標(biāo)志物在肝癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功運(yùn)用酶標(biāo)儀結(jié)合ELISA技術(shù)完成了血清中腫瘤標(biāo)志物AFP含量的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的酶標(biāo)儀能夠準(zhǔn)確測(cè)定微孔板中樣本的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到的樣本AFP濃度具有較高的可靠性。不同疾病組患者血清中AFP含量存在顯著差異，與臨床認(rèn)知相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了AFP在腫瘤診斷中的重要作用。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的操作流程和數(shù)據(jù)分析方法為其他基于酶標(biāo)儀的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)提供了參考范例，有助于推動(dòng)相關(guān)科研和臨床檢測(cè)工作的開(kāi)展。在未來(lái)的研究中，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，深入探究AFP含量與腫瘤分期、預(yù)后等因素的關(guān)系，為腫瘤的精準(zhǔn)診療提供更豐富的依據(jù)。